Algoritmo de aislamiento de Listeria

GLOSARIO

Gram positiva: se denominan asi aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de Gram-positivas o grampositivas.^{[ ]}Esta característica Química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria.^[] Las restantes son las bacterias Gram negativas.

Esporulante: Termino que se da cuando un microorganismo  tiene la capacidad de producir esporas, ejemplo: el Bacillus anthracis es una bacteria esporulante.

Psicotrofos: Son aquellos microorganismos  que pueden multiplicarse a una temperatura de 7 ° C o menos, estos se encuentrar por lo tanto en ambientes frios.

Catalasa positiva: La prueba de catalasa se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Cuando se determina la presencia de catalasa la bacteria se denomina de catalasa positiva.

Oxidasa negativa: Prueba utilizada para la detección de la enzima citocromo-c-oxidasa, presente en los géneros Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Cuando esta prueba es negativa la bacteria se denomina de osidasa negativa.

Hemolitico: termino que se da a un microorganismo que produce hemolisis que es la liberación de la hemoglobina contenida en el glóbulo rojo, consecuencia de una alteración de la pared del glóbulo (hemólisis química).

Hemosilina: Es una proteína de bajo peso molecular que produce lisis de los eritrocitos, leucocitos y plaquetas mediante la producción de poros en la membrana citoplasmática. Es un factor de virulencia en un gran número de bacterias patógenas.

aerobio facultativo: Dícese del microorganismo que tolera la falta de oxígeno aunque su principal fuente de energía la obtiene de la respiración aeróbica.

Rhamnosa: La ramnosa es un monosacárido de seis carbonos que pertenece al grupo de las metilpentosas y de las desoxihexosas.  Su nombre proviene de la planta de la cual se aisló por primera vez, la especie Rhamnus frangula, aunque también puede  encontrarse en forma de glicósido en la pared de ciertos microorganismos, como las micobacterias, que incluyen a los microorganismos causantes de la tuberculosis.^[]

Xilosa: La xilosa también llamada azúcar de madera, es una aldopentosa  (monosacárido) que contiene cinco átomos y que contiene un grupo que tiene un isómero funcional que es la xilulosa. Es uno de los ocho azúcares que son esenciales para la nutrición humana.

aguas cloacales: también llamadas aguas servidas, fecales o residuales, define un tipo de agua que está contaminada con sustancias fecales y orina, procedentes de desechos orgánicos humanos o animales. Su importancia es tal que requiere sistemas de canalización, tratamiento y desalojo. Su tratamiento nulo o indebido genera graves problemas de contaminación.

Neonatos: Un neonato o recién nacido es un bebé que tiene 27 días o menos desde su nacimiento, bien sea por parto o por cesárea. Este es un periodo importante ya que  Durante los primeros 30 días de vida, se pueden descubrir la mayoría de los defectos congénitos y genéticos.

Biofilm: Una biopelícula o biofilm es un ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios microorganismos asociados a una superficie viva o inerte, con características funcionales y estructuras complejas. Este tipo de conformación microbiana ocurre cuando las células planctónicas se adhieren a una superficie o sustrato, formando una comunidad, que se caracteriza por la excreción de una matriz extracelular adhesiva protectora. Una biopelícula puede contener aproximadamente un 15% de células y un 85% de matriz extracelular. Esta matriz generalmente esta formada deexopolisacáridos, que forman canales por donde circulan agua, enzimas, nutrientes, y residuos. Allí las células establecen relaciones y dependencias: viven, cooperan y se comunican a través de señales químicas, que regulan la expresión de genes de manera diferente en las distintas partes de la comunidad, como un tejido en un organismo multicelular.

las siglas ICMSF: Es la Comisión Internacional para la Especificación  Microbiológica de los  Alimentos (en inglés,  International Comssion on Microbiological Specification  for Food) y forma parte de la Organización Mundial para la Salud (OMS).  Está constituida por representantes de la mayoría de los países en el mundo.  ICMSF surgió por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos  estableciendo límites microbiológicos, métodos de análisis y de muestreo.

Rumiantes: Un rumiante es un animal que digiere los alimentos en dos etapas, primero los consume y luego realiza la rumia. Ésta consiste en regurgitar el material semidigerido y volverlo a masticar para deshacerlo y agregarle saliva. Los rumiantes son mamíferos artiodáctilos patihendidos (cuyas extremidades terminan en un número par de dedos, de los cuales apoyan en el suelo por lo menos dos, que son simétricos), que se alimentan de vegetales, carecen de dientes incisivos en la mandíbula superior, y tienen el estómago compuesto de cuatro cavidades, como las vacas, ciervos, carneros, cabras, etc.

Zoonótica: La zoonosis es la infección o enfermedad del animal que es transmisible al ser humano en condiciones naturales o viceversa. El término deriva de dos vocablos griegos:  zoon (“animal”)  y nósos  (“enfermedad”). En un sentido más específico, la enfermedad que se transmite del animal al hombre es la antropozoonosis, mientras que aquella que se transmite de la persona al animal se conoce como zooantroponosis. Una enfermedad que es producida por zoonosis se determina una enfermedad zoonotica, por ejemplo el dengue, la gripe aviar, la fiebre amarila, etc.

Acriflavina: Cloruro de 3,6-diamino-10-metilacridinio mezclado con 3,6-acridinediamina. Colorante fluorescente utilizado como antiséptico local y también como colorante biológico. Se intercala en lo Ácidos Nucleicos inhibiendo por consiguiente la Replicación Viral y bacteriana.

Nalidíxico: El ácido nalidíxico es un antibiótico del grupo de las quinolonas, activa en contra de Gram negativas. A concentraciones menores actúa como bacteriostático, es decir, inhibe el crecimiento y reproducción bacteriana, sin matar el organismo. A concentraciones más elevadas actúa como bactericida, es decir, mata la bacteria en vez de simplemente inhibir su reproducción. El ácido nalidíxico se usa en el tratamiento de infecciones urinarias causadas por microorganismos como Escherichia coli, Proteus, Shigella,Enterobacter, y Klebsiella. Se emplea también en estudios de los mecanismos de regulación de la división bacteriana.

Cicloheximina: Es un inhibidor de la síntesis proteica en organismos eucariotas, y es producida por la bacteria Streptomyces griseus. Actúa interfiriendo la actividad peptidil transferasa del ribosoma 60S, bloqueando la elongación traduccional. Tiene un uso extendido en la investigación biomédica para inhibir la síntesis de proteínas en células eucariotas in vitro. Su costo es bajo y actúa rápidamente, siendo sus efectos revertidos al quitarla del medio de cultivo.

Aséptico: Que está libre de suciedad y gérmenes que puedan producir enfermedades. Por ejemplo: el material usado es asepctico.

Moxolactam:

Caja petri: La placa de Petri, o cápsula de Petri, es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética. Es parte de la colección conocida como «material de vidrio». Se utiliza en la  microbiología, en los laboratorios, principalmente para el cultivo de bacterias, mohos y otros microorganismos, soliéndose cubrir el fondo con distintos medios de cultivo (por ejemplo agar) según el microorganismo que se quiera cultivar.

estria cruzada: técnica de siembra para microorganismos que consiste en realizar estrias que se tocan en uno de sus extremos y que están en direcciones opuestas, esta técnica tiene el propósito de aislar las colonias en un cultivo para facilitar su análisis posterior.

Inhibir: Disminuir o suspender las funciones normales de una parte del organismo por medios mentales o químicos.

SIM: Es un medio de cultivo semisólido destinado a verificar la movilidad, la producción de lindol y de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia enterobacteriaceae.                     
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Diagrama de bloques para realizar la esterilización del material.

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Técnicas de esterilización para medios de cultivo y material a utilizar.

Materiales

Aceite de inmersión

Asas bacteriológicas

Cajas Petri

Cubreobjetos

Matraces Erlenmeyer de 500 ml

Lámpara de luz blanca

Lápiz graso o marcador

Lupa de bajo aumento

Pipetas volumétricas de 25, 10 y 1,0 ml

Portaobjetos escabado

Portaasas

Tubos de 16 x 125 mm

Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapón de rosca

Sistema de filtración con membranas con un tamaño de poro de 0,45 µm

Aparatos e instrumentos

Se requiere además de lo mencionado en la NOM-110-SSA1-1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, lo siguiente:

Incubadoras con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.

Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite (100 X) o microscopio de campo oscuro.


Fuente: NOM-110-SSA1-1994

                                                                                                                                                      pag. 12

Pruebas de identificación.

Preparación de agar a utiliaza en las muestras.

Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)

Cuadro 8. Agar ASTEL.

Ingredientes	Cantidad
Agar soya tripticaseína	40,0 g
Extracto de levadura	6,0 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.

Agar sangre de carnero

Cuadro 9. Ingredientes del agar sangre de carnero.

Ingredientes	Cantidad
Base de agar sangre	95,0 ml
Sangre de carnero desfibrinada	5,0 ml

Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 ml para la prueba de CAMP y de 15 a 20 ml para la prueba de hemólisis.

Caldo nitratos.

Cuadro 10. Ingredientes del caldo de citrato.

Ingredientes	Cantidad
Nitrato de potasio	1,0 g
Cloruro de sodio	0,5 g
Peptona	2,0 g
Agua	1000,0 ml

Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.

Medios para la prueba de movilidad

 Medio de SIM

Cuadro 11. Ingredientes medio SIM.

Ingredientes	Cantidad
Peptona de caseína	20,0 g
Peptona de carne	6,1 g
Sulfato de fierro y amonio	0,2 g
Tiosulfato de sodio	0,2 g
Agar	3,5 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.

Medio MTM.

Cuadro 12. Ingredientes del medio MTM.

Ingredientes	Cantidad
Extracto de carne	3,0 g
Peptona	10,0 g
Cloruro de sodio (NaCl)	5,0 g
Agar	4,0 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,4 ± 0,2.

Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos

Cuadro 13. Ingredientes para caldo purpura.

Ingredientes	Cantidad
Proteosa peptona No. 3	10,00 g
Cloruro de sodio	5,00 g
Extracto de carne	1,00 g
Púrpura de bromocresol	0,02 g
Agua	1000,00 ml

Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121 ± 1°C pH final 6,8 ± 0,2.

Agregar la solución del carbohidrato, previamente esterilizada, por filtración en cantidad suficiente para obtener una concentración final de 0,5 %.

Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4ºC y utilizarse como inóculo para realizar las pruebas de identificación.

Prueba de movilidad en fresco

Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersión en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro.

Las células de Listeria spp son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran.

Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.

Prueba de catalasa

Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%.

La formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo.

¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con una asa de plástico o palillo de madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas!

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)

Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus y R. equi:

Staphylococcus aureus         Rhodococcus equi

ATCC 49444  ATCC 6339

NCTC 7428    NCTC 1621

ATCC 25923

CIP 5710

Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e internacionales.

En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y, paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación). Después de 24 y 48 h de incubación a 35°C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa.

La figura 7  --   muestra la disposición de las estrías de los cultivos en una placa para la prueba de CAMP. La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la estría de S. aureus, y la hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las especies restantes no son hemolíticas en esta prueba.

Diseño de la inoculación en placas de agar sangre de carnero. Las líneas horizontales representan las estrías de la inoculación de cinco cepas. Las líneas verticales representan las estrías de inoculación de S. aureus (S) y R. equi (R). Las líneas sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones.

Cuadro 14. Diferenciación de las Especies de Listeria

Especies         Hemolítico      Reducción      Producción de            CAMP  (beta)a nitratos ácidos de

M         R         X         S.a      R.e

L. monocytogenes     +          -           -           +          -           +          -

L. ivanovii       +          -           -           -           +          -           +

L. innocua       -           -           -           bV       -           -           -

L. welshimeri  -           -           -           bV       +          -           -

L. seeligeri      +          -           -           -           +          +1        -

L. grayic          -           bV       +          bV       -           -           -

a          Sangre de carnero desfibrinada

bV       Variable

            L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable

M         Manitol

R         Ramnosa

X         Xilosa

S.a      Staphylococcus aureus

R.e      Rhodococcus equi

 Serología

La determinación de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones epidemiológicas sean cruciales.

Inocular en caldo de triptosa por 24 h a 35ºC. Transferir a dos tubos de agar inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35ºC. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuadro 15. Serología de las especies de Listeria

Especies	Serotipo
L. monocytogenes	1/2A, 1/2B, 1/2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4AB, 4B, 4C, 4D, 4E, "7"
L. ivanovii	5
L. innocua	4AB, 6A, 6B,
L. welshimeri	6A, 6B Un a
L. seeligeri	1/2B, 4C, 4D, 6B, Un a

           

Expresión de resultados

Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del género Listeria.

El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes.

 Informe de la prueba

Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Y si los resultados son negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de muestra.

  

Fuente: norma: NOM-110-SSA1-1994

Bacteriological Analitycal Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division of Microbiology. 6a. Ed. Washington D. C.

J., & M.P. Doyle. 1981 Listeriae and Erysipelothrix. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. A. Balows W. J. Hausler Jr., K.L. Herman, H.D. Isenberg, and J.J. Shadomy (Eds). American Society for Microbiology, Washington,                                                                                     pag.11