Pruebas de identificación.

Preparación de agar a utiliaza en las muestras.

Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)

Cuadro 8. Agar ASTEL.

Ingredientes	Cantidad
Agar soya tripticaseína	40,0 g
Extracto de levadura	6,0 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.

Agar sangre de carnero

Cuadro 9. Ingredientes del agar sangre de carnero.

Ingredientes	Cantidad
Base de agar sangre	95,0 ml
Sangre de carnero desfibrinada	5,0 ml

Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 ml para la prueba de CAMP y de 15 a 20 ml para la prueba de hemólisis.

Caldo nitratos.

Cuadro 10. Ingredientes del caldo de citrato.

Ingredientes	Cantidad
Nitrato de potasio	1,0 g
Cloruro de sodio	0,5 g
Peptona	2,0 g
Agua	1000,0 ml

Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.

Medios para la prueba de movilidad

 Medio de SIM

Cuadro 11. Ingredientes medio SIM.

Ingredientes	Cantidad
Peptona de caseína	20,0 g
Peptona de carne	6,1 g
Sulfato de fierro y amonio	0,2 g
Tiosulfato de sodio	0,2 g
Agar	3,5 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.

Medio MTM.

Cuadro 12. Ingredientes del medio MTM.

Ingredientes	Cantidad
Extracto de carne	3,0 g
Peptona	10,0 g
Cloruro de sodio (NaCl)	5,0 g
Agar	4,0 g
Agua	1000,0 ml

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,4 ± 0,2.

Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos

Cuadro 13. Ingredientes para caldo purpura.

Ingredientes	Cantidad
Proteosa peptona No. 3	10,00 g
Cloruro de sodio	5,00 g
Extracto de carne	1,00 g
Púrpura de bromocresol	0,02 g
Agua	1000,00 ml

Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121 ± 1°C pH final 6,8 ± 0,2.

Agregar la solución del carbohidrato, previamente esterilizada, por filtración en cantidad suficiente para obtener una concentración final de 0,5 %.

Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4ºC y utilizarse como inóculo para realizar las pruebas de identificación.

Prueba de movilidad en fresco

Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersión en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro.

Las células de Listeria spp son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran.

Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.

Prueba de catalasa

Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%.

La formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo.

¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con una asa de plástico o palillo de madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas!

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)

Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus y R. equi:

Staphylococcus aureus         Rhodococcus equi

ATCC 49444  ATCC 6339

NCTC 7428    NCTC 1621

ATCC 25923

CIP 5710

Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e internacionales.

En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y, paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación). Después de 24 y 48 h de incubación a 35°C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa.

La figura 7  --   muestra la disposición de las estrías de los cultivos en una placa para la prueba de CAMP. La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la estría de S. aureus, y la hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las especies restantes no son hemolíticas en esta prueba.

Diseño de la inoculación en placas de agar sangre de carnero. Las líneas horizontales representan las estrías de la inoculación de cinco cepas. Las líneas verticales representan las estrías de inoculación de S. aureus (S) y R. equi (R). Las líneas sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones.

Cuadro 14. Diferenciación de las Especies de Listeria

Especies         Hemolítico      Reducción      Producción de            CAMP  (beta)a nitratos ácidos de

M         R         X         S.a      R.e

L. monocytogenes     +          -           -           +          -           +          -

L. ivanovii       +          -           -           -           +          -           +

L. innocua       -           -           -           bV       -           -           -

L. welshimeri  -           -           -           bV       +          -           -

L. seeligeri      +          -           -           -           +          +1        -

L. grayic          -           bV       +          bV       -           -           -

a          Sangre de carnero desfibrinada

bV       Variable

            L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable

M         Manitol

R         Ramnosa

X         Xilosa

S.a      Staphylococcus aureus

R.e      Rhodococcus equi

 Serología

La determinación de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones epidemiológicas sean cruciales.

Inocular en caldo de triptosa por 24 h a 35ºC. Transferir a dos tubos de agar inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35ºC. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuadro 15. Serología de las especies de Listeria

Especies	Serotipo
L. monocytogenes	1/2A, 1/2B, 1/2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4AB, 4B, 4C, 4D, 4E, "7"
L. ivanovii	5
L. innocua	4AB, 6A, 6B,
L. welshimeri	6A, 6B Un a
L. seeligeri	1/2B, 4C, 4D, 6B, Un a

           

Expresión de resultados

Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del género Listeria.

El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes.

 Informe de la prueba

Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Y si los resultados son negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de muestra.

  

Fuente: norma: NOM-110-SSA1-1994

Bacteriological Analitycal Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division of Microbiology. 6a. Ed. Washington D. C.

J., & M.P. Doyle. 1981 Listeriae and Erysipelothrix. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. A. Balows W. J. Hausler Jr., K.L. Herman, H.D. Isenberg, and J.J. Shadomy (Eds). American Society for Microbiology, Washington,                                                                                     pag.11